Lajme

IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) është një analog i substratit të β-galaktozidazës, i cili është shumë i induktueshëm.Nën induksionin e IPTG, induktori mund të formojë një kompleks me proteinën represore, në mënyrë që konformacioni i proteinës së shtypësit të ndryshojë, në mënyrë që të mos mund të kombinohet me gjenin e synuar, dhe geni i synuar të shprehet në mënyrë efikase.Pra, si duhet të përcaktohet përqendrimi i IPTG gjatë eksperimentit?A është sa më i madh aq më mirë?
Së pari, le të kuptojmë parimin e induksionit të IPTG: operoni (elementi) i laktozës së E. coli përmban tre gjene strukturore, Z,Y dhe A, të cilët kodojnë përkatësisht β-galaktozidazën, permeazën dhe acetiltransferazën.lacZ hidrolizon laktozën në glukozë dhe galaktozë, ose në alo-laktozë;lacY lejon që laktoza në mjedis të kalojë përmes membranës qelizore dhe të hyjë në qelizë;lacA transferon grupin acetil nga acetil-CoA në β-galaktozid, i cili përfshin heqjen e efektit toksik.Përveç kësaj, ekziston një sekuencë operative O, një sekuencë fillestare P dhe një gjen rregullator I. Kodi i gjenit I është një proteinë shtypëse që mund të lidhet me pozicionin O të sekuencës së operatorit, në mënyrë që operoni (meta) të shtypet dhe fikur.Ekziston gjithashtu një vend lidhës për vendin e lidhjes së proteinës së aktivizuesit të gjenit katabolik-CAP në rrjedhën e sipërme të sekuencës inicuese P. Sekuenca P, sekuenca O dhe vendi i lidhjes CAP së bashku përbëjnë rajonin rregullator të operonit lac.Gjenet koduese të tre enzimave rregullohen nga i njëjti rajon rregullator për të arritur shprehjen e koordinuar të produkteve të gjeneve.

Në mungesë të laktozës, operoni lac (meta) është në gjendje shtypjeje.Në këtë kohë, shtypësi lac i shprehur nga sekuenca I nën kontrollin e sekuencës së promotorit PI lidhet me sekuencën O, e cila parandalon lidhjen e ARN polimerazës me sekuencën P dhe frenon fillimin e transkriptimit;kur është e pranishme laktoza, operoni lac (meta) mund të induktohet Në këtë sistem operoni (meta), induktori i vërtetë nuk është vetë laktoza.Laktoza hyn në qelizë dhe katalizohet nga β-galaktozidaza për t'u shndërruar në alolaktozë.Kjo e fundit, si një molekulë induktuese, lidhet me proteinën represore dhe ndryshon konformacionin e proteinës, gjë që çon në shkëputjen e proteinës represore nga sekuenca O dhe transkriptimin.Izopropiltiogalaktozidi (IPTG) ka të njëjtin efekt si alolaktoza.Është një nxitës shumë i fuqishëm, i cili nuk metabolizohet nga bakteret dhe është shumë i qëndrueshëm, ndaj përdoret gjerësisht në laboratorë.

Si të përcaktohet përqendrimi optimal i IPTG?Merrni E. coli si shembull.
Lloji E. coli BL21 i modifikuar gjenetikisht që përmban pGEX rekombinant pozitiv (CGRP/msCT) u inokulua në mjedis të lëngshëm LB që përmban 50 μg·mL-1 Amp dhe u kultivua gjatë natës në 37°C.Kultura e mësipërme u inokulua në 10 shishe me medium të lëngshëm LB 50 ml të freskët që përmban 50 μg·mL-1 Amp në një raport 1:100 për kulturën e zgjerimit dhe kur vlera OD600 ishte 0,6~0,8, IPTG iu shtua përqendrimit përfundimtar.Është 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Pas induksionit në të njëjtën temperaturë dhe të njëjtën kohë, prej tij u mor 1 mL tretësirë ​​bakteriale dhe qelizat bakteriale u mblodhën me centrifugim dhe iu nënshtruan SDS-PAGE për të analizuar ndikimin e përqendrimeve të ndryshme të IPTG në shprehjen e proteinave, dhe më pas. zgjidhni përqendrimin e IPTG me shprehjen më të madhe të proteinave.
Pas eksperimenteve, do të konstatohet se përqendrimi i IPTG nuk është aq i madh sa të jetë e mundur.Kjo është për shkak se IPTG ka një toksicitet të caktuar ndaj baktereve.Tejkalimi i përqendrimit do të vrasë gjithashtu qelizën;dhe në përgjithësi, shpresojmë që sa më shumë proteina e tretshme të shprehet në qelizë, aq më mirë, por në shumë raste kur përqendrimi i IPTG është shumë i lartë, do të formohet një sasi e madhe përfshirjeje.Trupi, por sasia e proteinave të tretshme u ul.Prandaj, përqendrimi më i përshtatshëm i IPTG shpesh nuk është sa më i madh aq më mirë, por sa më i ulët të jetë përqendrimi.
Qëllimi i induksionit dhe kultivimit të shtameve të modifikuara gjenetikisht është rritja e rendimentit të proteinës së synuar dhe zvogëlimi i kostove.Shprehja e gjenit të synuar nuk ndikohet vetëm nga vetë faktorët e llojit dhe nga plazmidi i shprehjes, por edhe nga kushte të tjera të jashtme, si përqendrimi i induktorit, temperatura e induksionit dhe koha e induksionit.Prandaj, në përgjithësi, përpara se të shprehet dhe pastrohet një proteinë e panjohur, është mirë të studiohet koha e induksionit, temperatura dhe përqendrimi i IPTG në mënyrë që të përzgjidhen kushtet e duhura dhe të merren rezultatet më të mira eksperimentale.