Produktet

Kuptimi i metabolizmit të strehuesit mikrobial është thelbësor për zhvillimin dhe optimizimin e proceseve biokatalitike të bazuara në qeliza të tëra, pasi dikton efikasitetin e prodhimit.Kjo është veçanërisht e vërtetë për biokatalizën redoks ku përdoren qelizat metabolike aktive për shkak të kapacitetit rigjenerues të kofaktorit/kosubstratit endogjen në bujtësin.Escherichia coli rekombinante u përdor për mbiprodhimin e prolin-4-hidroksilazës (P4H), një dioksigjenazë që katalizon hidroksilimin e L-prolinës së lirë në trans-4-hidroksi-L-prolinë me a-ketoglutarat (a-KG) si kosubstrat.Në këtë biokatalizator me qeliza të plota, metabolizmi qendror i karbonit siguron kosubstratin e kërkuar a-KG, duke bashkuar performancën biokatalitike të P4H drejtpërdrejt me metabolizmin e karbonit dhe aktivitetin metabolik.Duke aplikuar mjete të biologjisë eksperimentale dhe llogaritëse, të tilla si inxhinieria metabolike dhe (13) analiza e fluksit metabolik C ((13) C-MFA), ne hetuam dhe përshkruam në mënyrë sasiore përgjigjen fiziologjike, metabolike dhe bioenergjetike të biokatalizatorit të tërë qelizave. ndaj biokonversionit të synuar dhe identifikimit të pengesave të mundshme metabolike për inxhinieri të mëtejshme të rrugës racionale. Një shtam E. coli me mungesë të degradimit të prolinës u ndërtua duke fshirë gjenin putA që kodon prolin dehidrogjenazën.Biotransformimet e qelizave të tëra me këtë lloj mutant çuan jo vetëm në hidroksilimin sasior të prolinës, por edhe në një dyfishim të shkallës specifike të formimit të trans-4-L-hidroksiprolinës (hyp), krahasuar me llojin e egër.Analiza e fluksit të karbonit përmes metabolizmit qendror të sojit mutant zbuloi se kërkesa e rritur e a-KG për aktivitetin P4H nuk e rriti fluksin gjenerues të a-KG, duke treguar një funksionim të ciklit TCA të rregulluar fort në kushtet e studiuara.Në shtamin e tipit të egër, sinteza dhe katalizimi i P4H shkaktuan një reduktim të rendimentit të biomasës.Interesante, tendosja ΔputA kompensoi gjithashtu humbjen shoqëruese të ATP dhe NADH duke reduktuar kërkesat për energji të mirëmbajtjes me ritme relativisht të ulëta të marrjes së glukozës, në vend që të rriste aktivitetin e TCA. të jetë premtuese për katalizën produktive të P4H jo vetëm për sa i përket rendimentit të biotransformimit, por edhe për sa i përket shkallës së biotransformimit dhe marrjes së prolinës dhe rendimentit të hip në burimin e energjisë.Rezultatet tregojnë se, pas një nokauti putA, bashkimi i ciklit TCA me hidroksilimin e prolinës nëpërmjet kosubstratit a-KG bëhet një faktor kyç kufizues dhe një objektiv për të përmirësuar më tej efikasitetin e biotransformimeve të varura nga a-KG.